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    大鼠ELISA試劑盒實驗顯色分析

    ELISA試劑盒里的顯色液AB成分

    如果你是HRP的二抗,顯色液A、B的成分一般是H2O2TMB(或OPD),至于具體A是那一個B是那一個你要看說明書。
    HRP催化過氧化物H2O2,其反應式如下:DTMB(或OPD
    DH2+ H2O2= D+2H2O
    上式中,DH2為供氧體,H2O2為受氫體。在ELISA中,DH2一般為無色化合物,經酶作用后成為有色的產物,以便作比色測定。
    顯色是ELISA中的后一步溫育反應,此時酶催化無色的底物**有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內,陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。
    適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中,加入底物后的反應溫度和時間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行,時間一般不需要嚴格控制,有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯se情況適當縮短或延長反應時間,及時判斷。
    OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深,再延長反應時間,可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色,顯色反應應避光進行,顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD產物用硫酸終止后,顯色由橙黃色轉向棕黃色。
    TMB受光照的影響不大,可在室溫中置于操作臺上,邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩定性,宜在規定的適當時間閱讀結果。TMBHRP作用后,約40分鐘顯色達,隨即逐漸減弱,至2小時后即可*消退至無色。
    TMB的終止液有多種,疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪,是目視判斷的良好終止劑。此外,各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色,此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。

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